Realtime PCR là gì mà được coi là bước nhảy vọt về công nghệ cuối thế kỷ 20. Đây là tiền đề mở ra nhiều ứng dụng vượt bậc cho những nhà nghiên cứu trên toàn thế giới. Cùng tìm hiểu rõ hơn công nghệ này và những thông tin xung quanh Real-time PCR trong bài viết dưới đây nhé!
Realtime PCR là gì?
Tương tự với PCR, Realtime PCR cũng là kỹ thuật nhân bản DNA dựa vào chu kỳ nhiệt. Tuy nhiên, ở kỹ thuật PCR cần phải đợi PCR hoàn tất (end point) mới có thể tiếp tục sử dụng các kỹ thuật khác. Ví dụ như, điện di sản phẩm PCR trên gel agarose mới xác định được sự hiện diện của trình tự khuếch đại. Với kỹ thuật Realtime PCR, tín hiệu khuếch đại sẽ được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt, vì thế mà người thực hiện có thể theo dõi kết quả PCR mà không cần chờ đến khi hoàn tất hay thực hiện thêm những kỹ thuật khác.
Tìm hiểu kỹ thuật realtime PCR (Ảnh: Internet)
Ưu và nhược điểm của xét nghiệm Realtime PCR
Ưu điểm của RT – PCR
- Phương pháp lấy mẫu rất đơn giản và nhanh chóng
- Độ nhạy, độ đặc hiệu cao
- Khả năng bị lỗi hoặc nhiễm bẩn thấp bởi toàn bộ quy trình được thực hiện trong ống kín
- Đây là phương pháp chính xác nhất hiện nay trong việc xác định và chẩn đoán Covid-19
Nhược điểm của RT – PCR
- Đòi hỏi cần có thiết bị và cơ sở vật chất y tế cao
- Thời gian trả kết quả sẽ lâu hơn
- Chi phí cao
Biểu đồ khuếch đại của Realtime PCR
Để hiểu rõ hơn realtime PCR là gì, cùng tìm hiểu biểu đồ khuếch đại của nó. Biểu đồ này sẽ có trục tung (Y) là cường độ tín hiệu huỳnh quang đo được từ phản ứng PCR, trục hoành (X) sẽ là số chu kỳ nhiệt. Ở các chu kỳ đầu, tín hiệu huỳnh quang phát ra chưa đủ mạnh để máy có thể đo được, khi ấy đường tín hiệu sẽ nằm ngang hay còn gọi là tín hiệu nền. Khi bản sao DNA đủ lớn, máy bắt đầu ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra, tín hiệu này sẽ tăng lên sau mỗi chu kỳ nhiệt. Đây được gọi là giai đoạn lũy thừa hay log phase. Đến một chu kỳ nào đó khi phản ứng cạn kiệt nguyên liệu, enzyme Taq polymerase sẽ không hoạt động hiệu quả nữa sẽ dẫn đến tín hiệu không tiếp tục gia tăng. Đây gọi là giai đoạn bình nguyên.
Biểu đồ khuếch đại của quy trình Realtime PCR (Ảnh: Internet)
Biểu đồ khuếch đại realtime PCR trên đây cho thấy, chu kỳ ngưỡng (Ct) là chu kỳ có tín hiệu huỳnh quang trong ống PCR đã bắt đầu vượt qua đường tín hiệu nền. Trong phản ứng RT – PCR, sẽ tùy theo lượng mẫu ban đầu mà Ct xuất hiện sớm hay muộn. Nếu mẫu ban đầu nhiều, Ct sẽ xuất hiện sớm và ngược lại.
Đường chuẩn của Realtime PCR
Khi đem mẫu chuẩn có hàm lượng DNA đã được xác định đi pha loãng bậc 10 liên tiếp rồi đem tất cả các nồng độ đã pha loãng đi chạy RT – PCR. Kết quả sẽ thu được các giá trị chu kỳ ngưỡng Ct khác nhau. Đường biểu diễn mối liên hệ giữa hàm lượng DNA và Ct gọi là đường chuẩn realtime PCR. Trên đường chuẩn này sẽ cần quan tâm hai thông số quan trọng sau:
Hệ số tương quan R²: Hệ số này đánh giá độ chính xác của thao tác pipette, khi R² càng gần với giá trị 1 thì thao tác càng chính xác. Thông thường R² ≥ 0.99.
Hiệu quả khuếch đại E: Ở điều kiện lý tưởng, E = 100%, tuy nhiên ở thực tế, giá trị E chấp nhận được ở mức từ 90 đến 105%.
Đường chuẩn của Realtime PCR được dựng từ nồng độ của mẫu chuẩn và giá trị Ct (Ảnh: Internet)
Dựa vào giá trị Ct và đường chuẩn của mẫu đầu vào, có thể định lượng được chính xác hàm lượng DNA bên trong mẫu. Đây chính là ưu điểm vượt trội khi tìm hiểu Realtime PCR là gì so với PCR. Bởi ở kỹ thuật PCR, tín hiệu sẽ được quan sát khi phản ứng đã kết thúc, khi ấy cường độ tín hiệu không còn phản án tương quan chính xác được với lượng DNA đầu vào, do đó không thể sử dụng cho định lượng được.
Realtime PCR sử dụng mẫu dò TaqMan
Với kỹ thuật RT – PCR sẽ có khá nhiều cách khác nhau để tạo ra được tín hiệu huỳnh quang sau mỗi chu kỳ. Tiếp theo, Hapoin sẽ giới thiệu đến bạn cách dựa trên mẫu dò Taqman. Đây là loại mẫu dò (probe) được dùng phổ biến trong kỹ thuật realtime PCR. Thành phần ở phản ứng RT – PCR sử dụng mẫu dò TaqMan gần như là tương đồng với một phản ứng PCR thường, chỉ trừ việc trong thành phần sẽ có thêm mẫu dò TaqMan.
Nguyên lý hoạt động của mẫu dò TaqMan (Ảnh: Internet)
Mẫu dò TaqMan là một đoạn olio-nucleotide có độ dài khoảng 20 – 30bp, đầu 5′ có gắn một chất huỳnh quang (reporter), đầu 3′ gắn chất hấp thụ (quencher). Khi mẫu dò TaqMan còn nguyên vẹn thì quencher sẽ hấp thụ tất cả ánh sáng huỳnh quang do reporter phát ra. Khi mà phản ứng PCR diễn ra, mẫu dò bị Taq polymerase cắt mẫu dò bằng hoạt tính 5′ – 3′ exonuclease như hình trên đây. Khi ấy, reporter sẽ giải phóng tín hiệu huỳnh quang và không còn bị quencher hấp thụ.
Trong phản ứng RT – PCR, mồi thường có nhiệt độ nóng chảy ở 55 – 60 độ C, thấp hơn mẫu dò TaqMan khoảng 5 – 10 độ C để đảm bảo đầu dò luôn bắt cặp trước. Trình tự đích lựa chọn không nên dài quá 150bp để phản ứng diễn ra được tối ưu nhất.
Chu trình nhiệt của phản ứng RT – PCT sử dụng mẫu dò TaqMan bao gồm 2 giai đoạn sau:
- Biến tính ở nhiệt độ 94 – 95 độ C trong 15 đến 30 giây.
- Bắt cặp và kéo dài ở nhiệt độ 60 độ C trong 30 đến 60 giây.
Ứng dụng của kỹ thuật Realtime PCR là gì?
Kỹ thuật realtime PCR là phương pháp khuếch đại DNA và có thể đọc kết quả đồng thời ngay tại thời điểm phản ứng xảy ra. Kỹ thuật này là một bước tiến lớn, được ứng dụng phổ biến trong việc chẩn đoán bệnh, xác định kiểu gen gây bệnh và những sinh vật biến đổi gen. Nghiên cứu RT – PCR còn giúp phát hiện sự biến đổi trong biểu hiện của một DNA thông qua định lượng số phiên của mã gen.
Chẩn đoán bệnh truyền nhiễm ở người
Việc xác định bệnh truyền nhiễm, tác nhân gây bệnh và cách ly cá thể bệnh là điều quan trọng đối với các bệnh truyền nhiễm. Khi phương pháp chẩn đoán tác nhân gây bệnh dựa vào triệu chứng lâm sàng hoặc kiểm tra hình ảnh chưa rõ ràng thì realtime PCR sẽ được sử dụng. Kỹ thuật này cho biết được chính xác sự tồn tại và tải lượng của những tác nhân gây bệnh. Điều này giúp việc điều trị và ngăn ngừa dịch bệnh lây lan hiệu quả hơn.
Chẩn đoán bệnh trên thủy sản, thú y
Ngày nay, các bệnh lây truyền từ động vật sang người đang có xu hướng tăng lên. Bên cạnh những phương pháp thông thường, dựa trên cảm quan và triệu chứng thì xét nghiệm realtime PCR được đưa vào sử dụng. Nó gúp phát hiện sự hiện diện của virus, vi khuẩn gây bệnh trên vật nuôi. Kỹ thuật này không chỉ dùng cho mục đích chẩn đoán mà còn giúp cải thiện an toàn sinh học nhờ sự giám sát và theo dõi dịch bệnh.
Kỹ thuật realtime PCR được dùng để xác định tác nhân gây bệnh truyền nhiễm hiệu quả (Ảnh: Internet)
Xác định thực phẩm GMO
Thực phẩm GM (Genetically modified) hay thực phẩm biến đổi gen, chỉ các loại thực phẩm có thành phần từ động vật hoặc cây trồng biến đổi gen. Loại thực phẩm này đang gây tranh cãi về tính an toàn của nó. Việc kiểm nghiệm thực phẩm biến đổi gen sẽ giúp xác nhận và định lượng sinh vật biến đổi gen trong mẫu thực phẩm. Khi đó, kỹ thuật realtime PCR sẽ được dùng để xác định và dán nhãn cho hàm lượng GMO khi thực phẩm đó được xuất khẩu.
>>> Có thể bạn quan tâm: Cân phân tích là gì?
Kết luận
Trên đây, Hapoin đã cùng bạn đi tìm hiểu kỹ thuật Realtime PCR là gì và những ứng dụng tuyệt vời của nó trong khoa học, đời sống. Hy vọng những thông tin đó giúp ích được nhiều đến bạn. Đừng quên ghé thăm chuyên mục Tin tức Hapoin để được cập nhật thêm nhiều kiến thức mới nhé!
Jasmine Wu – Hapoin
